1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
(1)了解HPLC在中藥分析方面的應(yīng)用。
(2)熟悉梯度洗脫的設(shè)計(jì)和操作。
2、實(shí)驗(yàn)原理
中藥(植物藥)中，含有多種有機(jī)和無機(jī)化合物，如生物堿、黃酮、皂苷、多聚糖等。每一味中藥都有它獨(dú)特的一種或幾種主要有效成分。弄清中藥的有效成分是中藥分子藥理學(xué)的關(guān)鍵，川芎中的有效成分之一是藁木內(nèi)酯。中藥的傳統(tǒng)炮制法是水煎，因此很多水溶性(極性)物質(zhì)被提取出來，由于這些水溶性有機(jī)分子的協(xié)同作用，也會有很多脂溶性(非極性)物質(zhì)被提取出來。本實(shí)驗(yàn)采用反相HPLC體系來分離川芎提取液。在反相HPLC中，極性物質(zhì)先流出，非極性物質(zhì)后流出。要能在盡可能短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到較好的分離，選擇適當(dāng)極性的流動相是關(guān)鍵。對于較簡單的樣品可以采用均一的混合溶劑作為洗脫液(稱等強(qiáng)度洗脫)，但對于復(fù)雜的混合物，如中藥提取物，必須采用梯度洗脫的方法，既流動相的極性隨時(shí)間在變化，洗脫能力不斷增加，使各組分既能得到彼此的分離，又能使色譜峰分布均勻。
川芎中有機(jī)物在210～300nm范圍內(nèi)有較強(qiáng)的吸收。因此可采用紫外檢測器進(jìn)行檢測。采用外標(biāo)法(一點(diǎn)工作曲線法)對川芎的主要成分藁本內(nèi)酯進(jìn)行定量。
3、儀器與試劑
儀器：高效液相色譜儀，紫外檢測器，梯度淋洗裝置，溶劑脫氣裝置。
試劑：甲醇(色譜純)，水(重蒸去離子水)，川芎浸膏，藁本內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)樣品。
4、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟
(1)參照儀器使用說明，使儀器處于工作狀態(tài)。
(2)設(shè)置色譜參數(shù)：色譜柱為C18柱；流動相A為甲醇，B為水；流速為1.0mL／min，柱溫30℃；檢測波長270nm。
(3)配置藁本內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液：準(zhǔn)確稱量藁本內(nèi)酯標(biāo)樣，以甲醇為溶劑配置，濃度約為1000mg／L。
配置被測樣品：稱取川芎浸膏250mg，用甲醇溶解定容至50mL。
(4)先以50 %的甲醇／水溶劑等強(qiáng)度洗脫，用六通閥注入被測樣品，觀察分離情況。
(5)再以80％的甲醇／水溶劑等強(qiáng)度洗脫，重復(fù)(4)的操作。
(6)設(shè)置梯度程序：開始為90％的B，60min內(nèi)線性地改變?yōu)?00％A，用六通閥注入被測樣品，觀察分離情況。
(7)檢測波長分別設(shè)為260nm，280nm，注入被測樣品。
(8)選擇適宜的色譜條件(流動相，檢測波長)注入藁本內(nèi)酯標(biāo)樣，記錄保留時(shí)間和峰面積(用以定性和計(jì)算校正因子)，重復(fù)3次，取平均值(面積誤差小于3％)。
(9)注入被測川芎提取液樣品，重復(fù)3次，取平均值(面積誤差在3％之內(nèi))。
(10)按關(guān)機(jī)程序關(guān)機(jī)。
5、注意事項(xiàng)
(1)如果實(shí)驗(yàn)直接用市售川芎飲片作樣品時(shí)，可以稱取適量飲片，用水提取1h(保持微沸)，水提物用微孔膜過濾后直接進(jìn)樣，或用氯仿等溶劑萃取后進(jìn)樣。
(2)中藥提取物中成分復(fù)雜，所含糖類、蛋白類等物質(zhì)有可能使色譜柱性能下降，必要時(shí)將川芎浸膏用溫水溶解后，用氯仿或乙酸乙酯萃取，有機(jī)相作為樣品即可。
6、數(shù)據(jù)處理
(1)整理出不同條件下的色譜峰的保留時(shí)間、峰面積，計(jì)算藁本內(nèi)酯的分離度。
(2)用外標(biāo)法計(jì)算川芎浸膏中的藁本內(nèi)酯的含量。
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